一、范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高效液相色譜儀主要性能的測(cè)試方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于高效液相色譜儀(HPLC)、超高效液相色譜儀(UPLC)。

二、規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改版)適用于本文件。

GB/T 11606-2007 分析儀器環(huán)境試驗(yàn)方法 GB/T 26792-2011 高效液相色譜儀

GB/T 25472-2010 色譜數(shù)據(jù)工作站 GB/T 30433-2013 液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱

GB/T 32267-2015 分析儀器性能測(cè)定術(shù)語

GB/T 9008-2007 液相色譜法術(shù)語 柱色譜法和平面色譜法

三、條件要求

3.1 儀器工作條件

環(huán)境溫度：15℃~35℃；

相對(duì)濕度：20%~80%；

供電電源：電壓 220 V±22V，頻率 50 Hz±0.5 Hz，并接地良好；

室內(nèi)避免易燃、易爆和強(qiáng)腐蝕性氣體及強(qiáng)烈震動(dòng)、電磁干擾，有良好的通風(fēng)裝置。

3.2 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)用計(jì)量?jī)x器、儀表和玻璃器皿等均按有關(guān)規(guī)定，經(jīng)計(jì)量檢定單位檢定合格并滿足量程和精度的要求；

標(biāo)準(zhǔn)溶液與試劑：標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)使用滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并按照相關(guān)要求配制，各種試劑應(yīng)使用優(yōu)級(jí)純或分析純。

四、單元部件性能指標(biāo)的測(cè)試

4.1 恒流泵

4.1.1 密封性

4.1.1.1 設(shè)備與試劑

高壓截止閥一個(gè)，耐壓不小于儀器壓力上限 120%；精密壓力表一個(gè)，量程不小于儀器壓力上限的 120%，0.4 級(jí)；三通一個(gè)；秒表一塊，分度值不大于 0.1 s。

純水：二次蒸餾水，滿足《GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中上等水要求，以下同。

4.1.1.2 測(cè)試方法

通過三通將恒流泵、高壓截止閥和精密壓力表連接，恒流泵*高壓力設(shè)定為儀器壓力上限90%處。以純水為流動(dòng)相，待系統(tǒng)排出氣體，流量設(shè)置為 0.1 mL/min；運(yùn)行儀器，將高壓截止閥處于截流狀態(tài)，壓力將逐漸上升，達(dá)到儀器壓力上限 90%時(shí)，停止運(yùn)行；記錄此時(shí)壓力表示值 p1，保持 10min 后，記錄壓力示值 p2。按式(4-1)計(jì)算壓力降。

4.1.2 流量準(zhǔn)確度與精密度

4.1.2.1 設(shè)備與試劑

秒表一塊，分度值不大于 0.1 s；帶探針數(shù)字溫度計(jì)一支，分度值不大于 0.1℃；分析天平一臺(tái)，根據(jù)流量大小選擇合適載荷，測(cè)試質(zhì)量控制在天平載荷的 60%左右，準(zhǔn)確度不低于 II級(jí)，實(shí)際分度值不大于 0.1 mg；背壓裝置一個(gè)，在設(shè)定流量下可提供(8±2)MPa 背壓；合適規(guī)格的稱量瓶三個(gè)。

純水。

4.1.2.2 測(cè)試方法

連接恒流泵入口、出口管路，以純水為流動(dòng)相(將數(shù)字溫度計(jì)探針插入流動(dòng)相內(nèi)，測(cè)定此時(shí)流動(dòng)相的溫度)，分別設(shè)定儀器流量上限的 1%、10%和 50%，調(diào)整背壓在(8±2)MPa。待儀器運(yùn)行穩(wěn)定后，按照表 1 要求收集流動(dòng)相，采用秒表計(jì)時(shí)，記錄數(shù)據(jù)。分別按照式(4-2)、式(4-3)計(jì)算流量準(zhǔn)確度和精密度。

注：流量的設(shè)定可根據(jù)恒流泵的流量范圍而定，此處以流量上限為10 mL/min為例。

注：為方便起見，亦可采用檢定合格的液體流量計(jì)(精度不低于0.01 mL/min)測(cè)試流量準(zhǔn)確度與精密度。

4.1.3 壓力脈動(dòng)

4.1.3.1 設(shè)備與試劑

精密壓力表一個(gè)，量程不小于儀器壓力上限的 120%，0.4 級(jí)；背壓裝置一個(gè)：在設(shè)定 1.0 mL/min 流量下，在 0~30 MPa 范圍內(nèi)可調(diào)；秒表一塊，分度值不大于 0.1 s。

純水。

4.1.3.2 測(cè)試方法

依次連接恒流泵、精密壓力表、背壓裝置入口與出口管路，以純水為流動(dòng)相，設(shè)定流量為儀器流量上限的 10%，調(diào)整背壓為儀器壓力上限的 20%左右(如儀器壓力上限為 40 MPa，則背壓調(diào)整在(8±2)MPa；如儀器壓力上限為 100 MPa，則背壓調(diào)整在(20±2)MPa)。待儀器運(yùn)行穩(wěn)定后，監(jiān)測(cè)精密壓力表示值，記錄 10 min 內(nèi)的*大、*小壓力值及平均值(每間隔 1 min 讀數(shù)一次，計(jì)算平均值)。按照式(4-4)計(jì)算壓力脈動(dòng)率δp。

4.2 自動(dòng)進(jìn)樣器

4.2.1 進(jìn)樣準(zhǔn)確度與精密度

4.2.1.1 設(shè)備與試劑

分析天平一臺(tái)，準(zhǔn)確度不低于 II 級(jí)，實(shí)際分度值不大于 0.1 mg；2 mL 樣品瓶若干。

純水。

4.2.1.2 測(cè)試方法

啟動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣器，排除管路氣泡，清洗進(jìn)樣針，取 2 mL 的進(jìn)樣瓶，加入一定量的純水，用分析天平稱量，記錄數(shù)據(jù)。按表 2 執(zhí)行取樣，每次取樣結(jié)束后，均對(duì)進(jìn)樣瓶進(jìn)行稱量，記錄數(shù)據(jù)。按式(4-5)和式(4-6)進(jìn)行計(jì)算 SS 和 SR，作為進(jìn)樣準(zhǔn)確度與精密度*。

4.2.2 線性

4.2.2.1 設(shè)備與試劑

同 4.2.1.1。

4.2.2.2 測(cè)試方法

同 4.2.1.2，依次設(shè)定進(jìn)樣體積為 5uL，10uL，20uL，25uL，50uL(如樣品環(huán)體積為 100 uL)，每個(gè)體積連續(xù)測(cè)量三次，記錄數(shù)據(jù)，取算術(shù)平均值 m，與對(duì)應(yīng)的取樣體積作一元線性擬合校準(zhǔn)曲線，得出線性相關(guān)系數(shù) r。

4.2.3 殘留

4.2.3.1 設(shè)備與試劑

高效液相色譜儀系統(tǒng)一套，C18 色譜柱一支(滿足《GB/T 30433-2013 液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱》標(biāo)準(zhǔn)要求，理論塔板數(shù)不低于 18000，以下同)。

0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液；85%甲醇水溶液。

4.2.3.2 測(cè)試方法

將自動(dòng)進(jìn)樣器連入測(cè)試用高效液相色譜儀系統(tǒng)中，采用 C18 色譜柱連接自動(dòng)進(jìn)樣器出口與檢測(cè)器入口，啟動(dòng)儀器，設(shè)置檢測(cè)器波長為 254 nm，以 85%甲醇水溶液為流動(dòng)相，流量設(shè)定為 1.0 mL/min，平衡系統(tǒng)。啟動(dòng)進(jìn)樣器，排除管路氣泡，清洗進(jìn)樣針，取 2 mL 的進(jìn)樣瓶，加入一定量的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液，放入自動(dòng)進(jìn)樣器托盤指定位置。設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)，進(jìn)樣前后各清洗 1 次(清洗體積為系統(tǒng)體積的 3~5 倍)，依次注入 20uL 的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液和 100%甲醇溶液。重復(fù)測(cè)量三次，記錄色譜峰面積，取算術(shù)平均值，按式(4-7)計(jì)算殘留量。

4.2.4 *小進(jìn)樣時(shí)間

在色譜數(shù)據(jù)工作站上設(shè)定分析方法，編輯序列，進(jìn)樣量設(shè)為 20uL，選擇不洗針模式，點(diǎn)擊運(yùn)行序列，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，至完成進(jìn)樣，色譜工作站開始采集數(shù)據(jù)為止，記錄此過程的時(shí)間為*小進(jìn)樣時(shí)間。

4.3 色譜柱恒溫箱

4.3.1 溫度準(zhǔn)確度與精密度

4.3.1.1 設(shè)備與試劑

校準(zhǔn)過的帶探針數(shù)字溫度計(jì)一臺(tái)，分度值不大于 0.1℃；空色譜柱管一支。

4.3.1.2 測(cè)試方法

將數(shù)字溫度計(jì)探針放置在一支空色譜柱的中心，將空色譜柱固定在色譜柱溫箱內(nèi)放置色譜柱處，選擇 4℃(制冷 1)、室溫+10℃，40℃，溫度上限的 90%進(jìn)行測(cè)量。按溫度從低到高順序升溫，開機(jī)加熱或制冷 60 min 后，每隔 5 min 記錄一次數(shù)字溫度計(jì)顯示溫度 2，測(cè)試五次計(jì)算平均值。按照公式(4-8) 和( 4-9)計(jì)算溫度準(zhǔn)確度與精密度。

式中：

ts —溫度設(shè)定值誤差，作為溫度準(zhǔn)確度，℃；

—為5次測(cè)量的平均值，℃；

t0—溫度設(shè)定值，單位為攝氏度（℃）；

tc —控溫穩(wěn)定性，作為溫度精密度，℃；

tmax —x次測(cè)量*大值，℃；

tmin ——n次測(cè)量*小值，℃

注1：如色譜柱恒溫箱具有制冷功能時(shí)，才需測(cè)試； 注2：亦可通過計(jì)算機(jī)軟件實(shí)時(shí)檢測(cè)溫度變化曲線，待儀器穩(wěn)定后，記錄溫度曲線，計(jì)算溫度準(zhǔn)確度與精密度。

4.4 檢測(cè)器

4.4.1 通用性能指標(biāo)

4.4.1.1 靜態(tài)基線噪聲與漂移

(1)設(shè)備與試劑

色譜數(shù)據(jù)工作站一套，純水。

(2) 測(cè)試方法

按照表3要求，設(shè)定儀器參數(shù)，連接測(cè)試系統(tǒng)。開機(jī)預(yù)熱60 min后，記錄基線60 min；取60 min內(nèi)平行包絡(luò)線的中心線的起點(diǎn)與終點(diǎn)的差值作為檢測(cè)器的基線漂移(如圖1所示)；選取所記錄基線中噪聲較大的5 min作為計(jì)算噪聲的基線，以1 min為界畫平行包絡(luò)線(如圖2所示)，按式(4-10)計(jì)算短期基線噪聲。5個(gè)包絡(luò)線寬度的平均值，作為檢測(cè)器基線噪聲。

4.4.1.2 信噪比

(1)設(shè)備與試劑

色譜數(shù)據(jù)工作站一套；二元梯度系統(tǒng)一套(梯度誤差不大于±1%)或1 mL注射器一支；試劑：按照表4配制標(biāo)準(zhǔn)樣品。

(2)測(cè)試方法

將檢測(cè)器與二元梯度系統(tǒng)，以及色譜數(shù)據(jù)工作站連接好，按照表3設(shè)置儀器參數(shù)。開機(jī)預(yù)熱后，以甲溶液為流動(dòng)相A注入，1.0 mL/min的流量平衡系統(tǒng)，沖洗流通池至示值穩(wěn)定后歸零。然后以乙溶液為流動(dòng)相B注入流通池，檢測(cè)器示值穩(wěn)定后記錄響應(yīng)信號(hào)值，重復(fù)測(cè)試三次，取算術(shù)平均值。然后按式(4-11)計(jì)算信噪比(S/N)，噪聲計(jì)算方法參照4.4.1.1。

.................................... (4-11)

式中：

S/N—檢測(cè)器信噪比；

H—檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)值；

N—基線噪聲。

4.4.1.3 線性范圍與靈敏度

(1)設(shè)備與試劑

色譜數(shù)據(jù)工作站一套；1 mL 注射器一支；試樣：按照表 4 配制 1 個(gè)空白甲溶液，配制 10個(gè)系列濃度丙溶液。如紫外-可見檢測(cè)器配制試樣甲溶液：純水；試樣丙溶液：丙酮水溶液濃度依次為 0.1%、0.2%、0.3%、、1.0%。

(2)測(cè)試方法

將檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)工作站連接好，按照表3設(shè)置儀器參數(shù)。開機(jī)預(yù)熱后，用注射器直接向檢測(cè)池內(nèi)注入表4甲溶液，沖洗檢測(cè)池至示值穩(wěn)定后將檢測(cè)器回零。然后向檢測(cè)池內(nèi)依次注入表4乙溶液，充滿檢測(cè)池并使示值穩(wěn)定，記錄各濃度下的響應(yīng)信號(hào)值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)試三次，取算術(shù)平均值。以前五個(gè)濃度點(diǎn)和對(duì)應(yīng)響應(yīng)信號(hào)值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出后五點(diǎn)的理論響應(yīng)值，與對(duì)應(yīng)含量的響應(yīng)信號(hào)值比較，響應(yīng)信號(hào)值剛好大于計(jì)算值5%時(shí)，認(rèn)為曲線彎曲，此點(diǎn)濃度作為線性上限CH。 CL值測(cè)定(信噪比推算法)： 以4.4.1.2測(cè)得結(jié)果線性推算信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度，即作為線性下限CL。

*后，由CH/CL算出檢測(cè)器線性范圍，CH值測(cè)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率作為檢測(cè)器靈敏度。

4.4.2 紫外-可見檢測(cè)器/二極管陣列檢測(cè)器

4.4.2.1 波長準(zhǔn)確度與精密度

(1)設(shè)備與試劑

色譜數(shù)據(jù)工作站一套，1mL注射器一支,氧化鈥濾光片或0.4%氧化鈥的10%高氯酸溶液：特征波長為242 nm，361 nm，536 nm。另外，亦可參照GB/T 26792-2011，采用0.0601 mg/mL重鉻酸鉀的0.05 mol/L硫酸溶液(紫外吸收波長標(biāo)準(zhǔn)溶液，特征波長為235 nm，257 nm，313 nm和350 nm)測(cè)試。

(2)測(cè)試方法

將檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)工作站連接好，開機(jī)預(yù)熱穩(wěn)定后，將氧化鈥濾光片放置在流通池處或?qū)?.4%氧化鈥的10%高氯酸溶液注入流通池進(jìn)行光譜掃描，重復(fù)測(cè)試三次，記錄并保存，計(jì)算譜線波峰的波長示值與特征波長值之差。按照此法依次檢驗(yàn)各個(gè)特征波長的示值誤差，取其中*大值作為檢測(cè)器波長準(zhǔn)確度。計(jì)算重復(fù)三次中*大值與*小值之差作為檢測(cè)器波長精密度。

4.4.3 示差折光檢測(cè)器折光響應(yīng)值準(zhǔn)確度

4.4.3.1 設(shè)備與試劑

色譜數(shù)據(jù)工作站一套；1 mL 注射器一支或恒流泵一臺(tái)；0.872 mg/mL 丙三醇水溶液（對(duì)應(yīng)響應(yīng)值為 1×10-4RIU）和 0.436 mg/L 丙三醇水溶液（對(duì)應(yīng)響應(yīng)值為 5×10-5RIU）.純水。

4.4.3.2 測(cè)試方法

將檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)工作站連接好，開機(jī)預(yù)熱，首先將純水注入?yún)⒈瘸睾蜆悠烦?，沖洗穩(wěn)定后歸零；然后將 0.436 mg/L 和 0.872 mg/L 丙三醇水溶液依次注入樣品池，示值穩(wěn)定后，記錄響應(yīng)值，重復(fù)三次取算術(shù)平均值，*后與標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算 RIU 與 mV 的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

4.4.4 熒光檢測(cè)器波長準(zhǔn)確度與精密度

4.4.4.1 設(shè)備與試劑

色譜數(shù)據(jù)工作站一套，1 mL 注射器一支。

純水，或者 1×10-4 mg/mL 萘甲醇溶液。

4.4.4.2 測(cè)試方法

將檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)工作站連接好，開機(jī)預(yù)熱穩(wěn)定后，向檢測(cè)池內(nèi)注入純水，待檢測(cè)器示數(shù)穩(wěn)定后，分別設(shè)定純水拉曼光譜的激發(fā)/發(fā)射特征波長為 350 nm/397 nm，進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描，重復(fù)測(cè)試三次，記錄并保存光譜圖。按照此法依次檢驗(yàn)各個(gè)特征波長的示值誤差，取其中*大值作為檢測(cè)器波長準(zhǔn)確度。計(jì)算重復(fù)三次中*大值與*小值之差作為檢測(cè)器波長精密度。

另外，亦可采用1×10-4 mg/mL萘甲醇溶液測(cè)試，激發(fā)/發(fā)射特征波長為290 nm/330 nm。